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如何評(píng)估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量?
閱讀次數(shù):1379 發(fā)布時(shí)間:2023/2/21 9:43:20
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質(zhì)粒抽提過程中有很多步驟會(huì)影響/后的產(chǎn)量和質(zhì)量,那么如何評(píng)估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量呢?

目使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種常用的方法。

溶液中的核酸濃度可通過260 nm的吸光度方便地進(jìn)行計(jì)算。A260的數(shù)值處于0.1至1.0之間時(shí)測(cè)量結(jié)果具有良好的重復(fù)性,但當(dāng)A260數(shù)值小于0.1或大于1.0的時(shí)候,結(jié)果的可重復(fù)性將顯著下降。而且,3.0以上的讀值是無法使用的,它可能會(huì)潛在導(dǎo)致對(duì)DNA質(zhì)量的低估。因此,為了獲得可靠的DNA分光光度定量結(jié)果,A260的讀值需要處于0.1至1.0之間。當(dāng)檢測(cè)小量DNA時(shí),使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行的定量分析可能更為可靠。

造成較低的產(chǎn)率和質(zhì)量的可能因素有很多。為了確定存在問題的環(huán)節(jié),可于每一純化步驟都保留一小部分樣品,并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

制備樣本

如各個(gè)實(shí)驗(yàn)方案和下列表格中所示,從澄清裂解液(樣本1)、流出液(樣本2)、QC洗滌緩沖液的混合組分(樣本3)和QF/QN緩沖液洗脫產(chǎn)物(樣本4)中各取出部分樣品。使用1倍體積的異丙醇沉淀核酸,并使用70%的乙醇洗滌該沉淀,充分蒸干后重懸于10 µl pH8.0的TE緩沖液中。

樣本實(shí)驗(yàn)方案步驟 MidiMaxiMegaGiga(低拷貝數(shù)質(zhì)粒/科斯質(zhì)粒) QIAGEN-tip 100(低拷貝數(shù)質(zhì)粒/科斯質(zhì)粒)QIAGEN-tip 5001240 µl120 µl120 µl75 µl600 µl750 µl2240 µl120 µl120 µl75 µl50 µl24 µl3400 µl240 µl160 µl120 µl200 µl120 µl4100 µl60 µl22 µl20 µl50 µl30 µl(制備產(chǎn)物占樣本量的百分比)2%0.40%0.08%0.02%1%0.20%

瓊脂糖凝膠分析
在1%的瓊脂糖凝膠中,對(duì)于各個(gè)質(zhì)粒純化步驟中的對(duì)應(yīng)樣品各加入2 µl進(jìn)行電泳。

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