miRNA是大有希望的生物標(biāo)志物，但精確檢測和定量并不是一件易事。為此，捷克的研究人員近日評估了三種miRNA檢測技術(shù)，比較了它們的定量偏倚、一致性和穩(wěn)健性。他們在本期《BioTechniques》雜志上發(fā)表了分析結(jié)果。
目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種方法來檢測miRNA，包括RNA測序、芯片和RT-qPCR。測序法和芯片法的優(yōu)勢分別在于發(fā)現(xiàn)新穎的miRNA，或?qū)ふ遗c疾病相關(guān)的差異表達(dá)miRNA，適合高通量的miRNA分析，但不適合常規(guī)使用。對診斷領(lǐng)域而言，*具潛力的方法仍是金標(biāo)準(zhǔn)的RT-qPCR。
RT-qPCR方法大家都很熟悉，通常是先將成熟的miRNA轉(zhuǎn)化成cDNA序列，然后利用qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。這種技術(shù)可以在標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備上自動化開展，因此如今已被廣泛使用。qPCR方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性都是非常好的，但整個(gè)過程中*容易出錯(cuò)的步驟是逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)。
不過，*近又涌現(xiàn)出一些檢測miRNA的新穎方法。種方法稱為SplintR-qPCR，它保留了qPCR檢測過程，但改變了cDNA合成的過程。這種方法利用SplintR連接酶將與miRNA互補(bǔ)的探針A和探針B相連接，以取代RT過程。由于DNA探針與miRNA之間只需要4-6 bp的重疊，故在設(shè)計(jì)探針時(shí)具有更大的靈活性。
第二種方法是基于免疫分析的miRNA定量方法——miREIA。此方案是利用DNA探針與miRNA靶點(diǎn)進(jìn)行雜交，然后再利用獨(dú)特的單克隆
抗體對DNA/RNA雜交體進(jìn)行定量。它的檢測原理與ELISA相似，使用常規(guī)ELISA設(shè)備，便于臨床實(shí)驗(yàn)室開展。整個(gè)過程不涉及到RT或擴(kuò)增。
在此，研究人員比較了這三種檢測方法在臨床應(yīng)用中的表現(xiàn)。他們利用賽默飛的TaqMan miRNA assay或TaqMan Advanced assay開展RT-qPCR；或利用NEB的SplintR連接酶按照文獻(xiàn)中的方案開展SplintR-qPCR；或采用BioVendor的miREIA方案進(jìn)行檢測。他們檢測了30個(gè)樣本中miR-142-5p、miR-23a-3p和miR-93-5p的濃度。
研究人員發(fā)現(xiàn)繞開RT過程的方法所測得的濃度具有一致性，而RT-qPCR方法測得的濃度有三個(gè)對數(shù)的偏移，即測出的濃度大約高了1000倍。他們推測，可能的原因在于RT步驟本身。miRNA分子的長度僅為19-23個(gè)核苷酸，且序列非常相似，這就使得RT的引物設(shè)計(jì)非常復(fù)雜。
之后，他們又評估了這三種檢測方法的穩(wěn)健性。結(jié)果表明，miREIA技術(shù)的穩(wěn)健性*佳，對于全血和PBMC樣品，變異系數(shù)（CV）分別為17%和8%。SplintR-qPCR的結(jié)果很相似，CV分別為19%和16%。不過，RT-qPCR方法的穩(wěn)健性*差，CV分別為39%和50%。
基于此，研究人員認(rèn)為繞開RT過程的miRNA檢測方法更適合臨床應(yīng)用。不過，RT-qPCR仍然是*靈敏的方法，在miRNA測定中無疑將占有一席之地。同時(shí)，SplintR-qPCR和miREIA方法更加穩(wěn)健，絕對定量更精準(zhǔn)。它們適用于以組織和全血為樣本的臨床實(shí)驗(yàn)室，但在靈敏度方法還需要進(jìn)行一些開發(fā)工作。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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