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技術(shù)文獻(xiàn)

游離核酸抽提方法選擇指引遠(yuǎn)慕新聞√
閱讀次數(shù)：1471 發(fā)布時(shí)間：2019/8/22 10:37:06

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人體細(xì)胞在凋亡的過程中，DNA斷裂并分泌至細(xì)胞外。健康細(xì)胞，胎兒細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞以及移植的細(xì)胞都可以通過這種方式釋放游離DNA至血液中。同時(shí)cfDNA（cell-free DNA）是腫瘤和產(chǎn)前診斷研究中，被證實(shí)有用的標(biāo)記物。

隨著液體活檢技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)這些的游離核酸檢測有望成為替代組織活檢的重要方法。大家比較熟悉的游離核酸檢測手段有定量PCR、NGS等傳統(tǒng)方法和正在迅猛發(fā)展的數(shù)字PCR。

但cfDNA在體液中的含量非常低，通常血清中含量低于10ng/mL。如何從含量如此低的樣本中，抽提出適合檢測手段的游離核酸？

液體活檢技術(shù)的興起，使得游離核酸樣本的數(shù)量大增，高通量形式的核酸抽提成為了工作者們的追求，如何低成本解決通量問題？

那就從下方的描述中找到適合您的游離核酸抽提方式吧。

市面上的游離核酸抽提試劑盒大多是基于柱膜法的原理、還有一部分是基于磁珠法的抽提原理。有單管離心、多管真空抽濾、96孔板真空抽濾、磁珠法高通量等形式。*常用的為多管真空抽濾的方式。

多管真空抽濾

采用真空抽濾的方法，在真空抽濾裝置上，可同時(shí)提取24個(gè)1-10mL血清、血漿、尿液等樣本, 結(jié)合&洗滌過程無需使用離心機(jī)。大多客戶用此方法來抽提2-4mL血漿，得到的游離核酸用于后續(xù)的PCR、NGS、甲基化研究。整個(gè)抽提過程需要約45min-3h不等，具體的操作時(shí)間要根據(jù)使用的品牌來定。

NucleoSnap® DNA Plasma 僅需要45min 即可完成EDTA處理的血漿游離核酸的抽提，是目前提取速度較快的游離核酸提取試劑盒。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。

應(yīng)用數(shù)據(jù)：

從5mL EDTA血漿中純化cfDNA
NucleoSnap® DNA Plasma kit 和競爭對(duì)手（Competitor Q）比較結(jié)果

從Cell-Free DNA BCT® （Streck）提取cfDNA
3個(gè)不同Cell-free DNA BCT® 保存的樣品，分別使用 NucleoSnap® DNA Plasma （MN）和a vacuum-processed kit of a competitor （Q）提取cfDNA.使用Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit （Agilent）檢測，分離到的游離核酸在170bp附近有典型的峰（箭頭標(biāo)記）

10mL尿液中分離cfDNA電泳圖
抽提的cfDNA使用 Bioanalyzer™ 2100 with a High Sensitivity DNA Kit （Agilent）分析，在170bp附近有典型的片段分布

單管離心

單管離心抽提游離核酸的方法一般適用于小體積血清或者血漿樣本，通常樣本體積范圍在200uL-2mL。由于樣本上樣量少，游離核酸的得率也較多管真空抽濾的方式要低。此類方法得到的游離核酸一般用來進(jìn)行PCR、qPCR等分子檢測。

PCR需要的模板量一般是很低的。常規(guī)的20-30uL洗脫體積，一般只用到10%。有沒有一種方法可以讓洗脫體積更小，單位體積里面濃縮更豐富的核酸？

NucleoSpin® Plasma XS應(yīng)運(yùn)而生，采用獨(dú)特的設(shè)計(jì)，柱膜直徑是普通柱膜的一半，僅需要240uL 血漿，5-20uL洗脫液，就可以得到的高濃度核酸，后續(xù)的QPCR檢測靈敏度也更高。

洗脫體積的大小決定于柱膜直徑!

MN NucleoSpin® Plasma XS：柱膜面積*小，僅5–20 μL洗脫體積就可以得到有效的游離核酸.
Competitor Q （Q）：盡管此試劑盒適用于小樣本量，但是沒有針對(duì)此應(yīng)用做專門的設(shè)計(jì)，洗脫體積至少 20–30 μL.

NucleoSpin® Plasma XS非常適合孕婦血漿中游離核酸檢測。

應(yīng)用數(shù)據(jù)：

PCR檢測cfDNA中的RHD和Amelogenin基因NucleoSpin®Plasma XS和MagNA Pure Compact Nucleic Isolation Kit I – Large Volume相比，相同的上樣量 NucleoSpin®表現(xiàn)出更好的性能，分別提前2.6 cycles （RHD gene）和 2.1 cycles （Amelogenin）捕獲到PCR信號(hào)。
Data kindly provided by Dr. Doescher, DRK Blutspendedienst NSTOB, Oldenburg, Germany

PCR檢測cfDNA中k-ras基因NucleoSpin® Plasma XS 和QIAamp DNA Blood Midi相比，NucleoSpin® Plasma XS在低于2.7倍PCR上樣量的同時(shí)，提前2.1cycles捕獲到PCR信息。
Data kindly provided by Dolores C. García-Olmo, PhD, Unidad de Investigación, Complejo Hospitalario Universitario de Albacete, Albacete, Spain

談?wù)摰絾喂茈x心的方式提取游離核酸，還要給大家介紹一款產(chǎn)品Covaris truXTRAC™ cfDNA。

Covaris truXTRAC® cfDNA提取試劑盒配合Covaris自動(dòng)聚焦超聲技術(shù)（Adaptive Focused Acoustics，AFA），主動(dòng)解交聯(lián)提取cfDNA，相比傳統(tǒng)方法，cfDNA提取的得率、質(zhì)量和復(fù)雜度都得到顯著提高，更少的血液量即可滿足下游檢測分析需求。同時(shí)除提取單核小體凋亡cfDNA外，還可獲取血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA和非凋亡長片段cfDNA，幫助后續(xù)研究獲取更多疾病相關(guān)信息！

truXTRAC® 獲取的cfDNA種類更豐富：

不同cfDNA提取方法獲得cfDNA片段分析
用truXTRAC cfDNA和傳統(tǒng)柱提取法Q試劑盒從相同臨床血液樣本中提取的cfDNA通過Fragment Analyzer（AATI）分析。結(jié)果顯示truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術(shù)，無基因組DNA污染，除提取到單核小體凋亡cfDNA外，還獲得了血液中少量存在的核小體二聚體、三聚體cfDNA片段和非凋亡長片段cfDNA，幫助后續(xù)研究獲得更多信息，如檢測癌癥患者是否存在耐藥性突變等。

truXTRAC® 顯著提高cfDNA得率：

不同cfDNA提取方法得率比較
用truXTRAC cfDNA和傳統(tǒng)柱提取法Q試劑盒從相同10個(gè)臨床血液樣本提取cfDNA。cfDNA得率使用Qbit檢測，柱狀圖表示得率范圍，X表示10個(gè)供體cfDNA得率的平均值。結(jié)果顯示Covaris truXTRAC cfDNA試劑盒配合AFA技術(shù)，顯著提高cfDNA得率。

96孔板真空抽濾

采用柱膜法原理抽提游離核酸，一次可以抽提96個(gè)樣本，極大的方便了樣本量較多的客戶。

此類產(chǎn)品一般只適用2mL血漿、血清等樣品，提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。
此類提取方法的代表試劑盒就是NucleoSpin® 96 DNA Plasma。此試劑盒可以在真空抽濾自動(dòng)化核酸抽提平臺(tái)使用，比如：Eppendorf。

NucleoVac 96 Vacuum Manifold

也可以在真空抽濾裝置NucleoVac 96 Vacuum Manifold上使用，此類方法可以極大地節(jié)省購買儀器的費(fèi)用。

應(yīng)用數(shù)據(jù)：

采用96孔板抽濾的方式，從2mL血漿中抽提cfDNA的得率結(jié)果
無論是不同個(gè)體還是不同的采血管均能得到較好的游離核酸抽提結(jié)果

磁珠法高通量

磁珠法是*容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化通量抽提的一種核酸抽提方式，可處理1-10mL血漿樣品，形式也更靈活。提取到的游離核酸可用于NGS, qPCR, ddPCR等檢測手段。

磁珠法得率的高低主要取決于試劑盒中磁珠的類型。NucleoMag® DNA Plasma采用MN 磁珠- 超順磁性。“超順磁性”代表磁珠可以被磁場吸附，但是自身不會(huì)被磁化，不會(huì)聚集在一起，很容易在溶液中被懸浮；磁珠直徑 1–3 µm，能夠保證沉降時(shí)間，更有利于HTP處理方式，此外小珠有更大的聚集表面積，這也是磁珠擁有結(jié)合能力所必須的。