糖基化可能會影響
蛋白質(zhì)的半衰期、免疫原性、結(jié)合活性和穩(wěn)定性。蛋白糖基化是個復(fù)雜的過程，包括碳水化合物部分的連接，以及可能通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的天冬酰胺（N-連接）或絲氨酸/蘇氨酸（O-連接）氨基酸連接的位置。在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用不同的細(xì)胞系培養(yǎng)可能會在可能發(fā)生的糖基化類型上產(chǎn)生重大差異。糖基化的這些差異可能會對所產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)的質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，細(xì)胞克隆的選擇、所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基也會對糖基化產(chǎn)生影響。
蛋白質(zhì)藥物在生產(chǎn)中使用的宿主細(xì)胞的選擇和生物反應(yīng)器條件會顯著影響蛋白質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量。這既是由蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定，也是由在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能發(fā)生的特異性翻譯后修飾所決定的，其中糖基化對藥物的質(zhì)量特別重要。
蛋白質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)對蛋白質(zhì)質(zhì)量的影響
生物藥物是具有聚合物結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)是從氨基酸序列（稱為結(jié)構(gòu)）開始，通過將氨基酸鏈折疊成局部，二結(jié)構(gòu)和三構(gòu)象。多鏈蛋白，例如IgG
抗體，還具有由亞基之間的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的四結(jié)構(gòu)。
用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細(xì)胞系的選擇先取決于蛋白質(zhì)的分子特性。某些細(xì)菌可用于生產(chǎn)簡單的蛋白質(zhì)，即僅由氨基酸聚合物組成的蛋白質(zhì)，沒有諸如糖基化的翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM），因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)菌菌均無法進(jìn)行糖基化。使用簡單的培養(yǎng)基即可快速進(jìn)行生產(chǎn)；但是，在純化工藝上可能具有挑戰(zhàn)性。使用酵母可以快速產(chǎn)生具有原始糖基化的蛋白質(zhì)。通常與桿狀病毒載體起以瞬時表達(dá)的方式，
昆蟲細(xì)胞主要用于研發(fā)和基本產(chǎn)品。哺乳動物細(xì)胞用于生產(chǎn)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，例如抗體和酶，需要完整的PTM，包括有些復(fù)雜的碳水化合物。
下圖1中顯示IgG抗體的結(jié)構(gòu)，糖基化位點(diǎn)和潛在的變異性。與小分子藥物相比，蛋白質(zhì)是易碎分子，面臨多重穩(wěn)定性挑戰(zhàn)。典型的糖蛋白（例如IgG抗體）在其結(jié)構(gòu)內(nèi)具有許多可變位點(diǎn)，包含了四條鏈，總分子量為150000 Da。另外，可能發(fā)生蛋白質(zhì)鏈的幾種翻譯后修飾，例如特定氨基酸的氧化和脫酰胺。每條重鏈還可以發(fā)生糖基化位點(diǎn)。
圖1：顯示IgG抗體結(jié)構(gòu)，糖基化位點(diǎn)和潛在變異性示意圖。
為什么糖基化很重要？
許多復(fù)雜的蛋白質(zhì)，例如抗體和酶，都是糖蛋白，含有2–30％的碳水化合物。糖基化是個復(fù)雜的過程，碳水化合物通過天冬酰胺（N-連接）或絲氨酸/蘇氨酸（O-連接）氨基酸附著到蛋白質(zhì)上。蛋白中可能含有多種糖類型，每種糖都有多個附著位點(diǎn)，生產(chǎn)中使用的哺乳動物細(xì)胞變異會導(dǎo)致細(xì)微的糖基化差異。
細(xì)胞克隆的選擇會影響產(chǎn)品質(zhì)量。每個克隆的糖基化和PTM能力略有不同，并且活力各不相同，從而導(dǎo)致釋放到培養(yǎng)基中的細(xì)胞內(nèi)降解酶的差異。因此，可能有必要選擇的細(xì)胞株不是高表達(dá)量的細(xì)胞克隆，而是可以實(shí)現(xiàn)所需的蛋白質(zhì)質(zhì)量的細(xì)胞株。
細(xì)胞培養(yǎng)條件的影響
影響糖基化類型和程度的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)包括pH、CO2含量、溶氧量（dO2）、溫度、 營養(yǎng)素水平和種類、聚糖體的存在和類型、細(xì)胞存活力，因?yàn)榇顾赖募?xì)胞釋放降解酶、和工藝過程控制水平。
與搖瓶相比，生物反應(yīng)器可提供對pH和溶解氣體的更大控制，因此可實(shí)現(xiàn)更好的過程控制，但搖瓶更經(jīng)濟(jì)，可輕松使用更大數(shù)量或更大的規(guī)模。因此，搖瓶通常用于培養(yǎng)基和補(bǔ)料條件的早期篩選研究。通過與生物反應(yīng)器合作，通過選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)補(bǔ)料以及添加這些補(bǔ)料的時間來提高生長和生產(chǎn)力，從而實(shí)現(xiàn)佳的細(xì)胞培養(yǎng)；還可以通過優(yōu)化生物反應(yīng)器的充氧條件，例如CO2水平、pH、攪拌、溫度、接種密度和分配比；通過使用溫度變化來延長細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)階段的活率；并大程度地減少諸如氨等抑制生長的代謝物的積累。
近，微型生物反應(yīng)器的可用性提供了進(jìn)行多參數(shù)研究的有效途徑。因此，可以進(jìn)行“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”（DoE）研究的方法，在該方法中可以同時評估多個相互反應(yīng)的生物反應(yīng)器條件。此類研究要求使用自動化的大量生物反應(yīng)器以使該過程可行。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
客服一
