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技術(shù)文獻

細胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧
閱讀次數(shù):1115 發(fā)布時間:2021/6/15 10:12:56
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  細胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括:電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等,理想的細胞轉(zhuǎn)染方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對細胞的毒性作用小等,本文主要介紹細胞轉(zhuǎn)染常用的方法-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和操作步驟等。



一、脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理

脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。

優(yōu)點:與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復(fù)性,它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目條件下蕞方便的轉(zhuǎn)染方法。

二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟

(1)細胞培養(yǎng):取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液,37℃ CO2培養(yǎng)密度至40%~60%,密度過大,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備:在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)

A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug 質(zhì)粒DNA。

B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。

分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。

(3)吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。

(4)轉(zhuǎn)染準備:用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。

(5)轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(6)瞬時轉(zhuǎn)染后,可在48h-72h細胞長滿之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過表達效率。

注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

原創(chuàng)作者:上海遠慕生物科技有限公司

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