(一)實驗?zāi)康?br />了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，用顯微鏡直接測定微生物總細(xì)胞數(shù)。
(二)實驗原理
測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數(shù)法和稀釋平板計數(shù)法。
直接計數(shù)法適用于各種單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，則難于直接測定。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同、只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細(xì)菌難于區(qū)分。
血球汁數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽所構(gòu)成的3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)，計數(shù)區(qū)的刻度應(yīng)有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格(大方格用三線隔開)，而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格(大方格之間用雙線分開)，而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點(diǎn)，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。
計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為1mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1／4000mm3。
使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。
已知：1mL體積＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3
所以：1mL體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3／(1／4000mm3)＝4x106個小方格。即系數(shù)K＝4x106。因此：每mL菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)=每個小格中細(xì)胞平均數(shù)(N) x系數(shù)(K) x菌液稀釋倍數(shù)(d)。
（三)實驗器材
(1)活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )斜面菌種或培養(yǎng)液。
(2)器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片(22mm x 22mm)、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。
（四）實驗方法
(1)視待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋(斜面一般稀釋到10-2)，以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。
(2)取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
(3)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過多)，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，注意不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。
(4)靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下觀察到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)適當(dāng)關(guān)小孔徑光闌并減弱光照的強(qiáng)度。
(5)計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)．除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)(即80個小格)。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。
(6)對于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2—3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作)，求出每一個小格中細(xì)胞平均數(shù)(N)，按公式計算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。
(7)測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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