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技術(shù)文獻(xiàn)

遠(yuǎn)慕生物:轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技巧了解一下!
閱讀次數(shù):1027 發(fā)布時(shí)間:2021/10/11 9:58:20
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  轉(zhuǎn)染可謂是做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的大家經(jīng)常會(huì)考慮的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù),大致原理也都是明白的。到底轉(zhuǎn)染是什么呢,為什么轉(zhuǎn)染效率不高呢,-天我們就來(lái)一起討論一下其中奧妙吧。

轉(zhuǎn)染,就是在真核細(xì)胞里導(dǎo)入具有生物功能的核酸,并在細(xì)胞中維持其生物功能。

轉(zhuǎn)染方法的選擇

我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導(dǎo),化學(xué)介導(dǎo),生物介導(dǎo)。但實(shí)驗(yàn)室使用較多的主要有化學(xué)介導(dǎo)中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)和生物介導(dǎo)中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡(jiǎn)單,一般瞬時(shí)轉(zhuǎn)染選擇較多,但有些細(xì)胞系不容易轉(zhuǎn)染,因此選擇轉(zhuǎn)染方式時(shí)一定要做足功課,親身經(jīng)歷告訴我,千萬(wàn)不要圖方便,否則轉(zhuǎn)染效率簡(jiǎn)直崩潰。特別是養(yǎng)原代細(xì)胞的小伙伴,一點(diǎn)要認(rèn)真選擇!病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢(shì),且其對(duì)原代細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率,其中更分為慢病毒轉(zhuǎn)染,逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染,其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合更為難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,例如懸浮細(xì)胞、T細(xì)胞、raw細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞狀態(tài)

眾suo周知,細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,原代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是-佳選擇,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)-期的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)-好,shi合轉(zhuǎn)染。同時(shí),我們都知道細(xì)胞的密度不宜過(guò)大,大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染的密度,失敗過(guò)很多次的經(jīng)歷告訴大家,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度更加重要。有時(shí)候轉(zhuǎn)染時(shí)間太久,等到進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞已經(jīng)肆意生長(zhǎng),漂起來(lái)了,豈不功盡棄,流著眼淚也要告訴大家,考慮好細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和轉(zhuǎn)染的時(shí)間進(jìn)行鋪板,建議選擇50%~80%區(qū)間密度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2、實(shí)驗(yàn)污染

跟細(xì)胞有關(guān)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)然要注意不能污染啦,細(xì)菌,真菌,支原體都是應(yīng)該嚴(yán)格注意的,不僅會(huì)浪費(fèi)試劑,也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(注:支原體污染不易觀察到,轉(zhuǎn)染可用環(huán)丙沙星處理避免污染)

3、轉(zhuǎn)染試劑的處理

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:1. 質(zhì)粒的純度會(huì)影響轉(zhuǎn)染的效率,如果質(zhì)粒不純,其含有少量的鹽,蛋白會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染復(fù)合體的形成,因?yàn)閮?nèi)毒素嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率,還需進(jìn)行質(zhì)粒內(nèi)毒素的處理。

2. 其次如選用lipo2000或lipo3000,需注意嚴(yán)格按照說(shuō)明書的加樣順序添加,其中mix well只需用槍輕輕混勻或手指輕輕晃動(dòng),切忌用力吹打,會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體失去作用。

3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)需用無(wú)血清的Opti-MEM Medium,關(guān)于是否嚴(yán)格控制雙抗,hao咨詢一下轉(zhuǎn)染試劑廠家技術(shù),本實(shí)驗(yàn)室用的lipo3000咨詢過(guò)技術(shù)支持,說(shuō)使用雙抗并不影響轉(zhuǎn)染效率,害怕污染的小伙伴們可以放心使用啦。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求,如需進(jìn)行劃痕,transwell等培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn),-好使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,而我的實(shí)驗(yàn)-后收細(xì)胞只需檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)不用較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng),選擇瞬轉(zhuǎn)即可。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一般是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,如需篩選穩(wěn)定株需要在藥物的作用下,因常用質(zhì)粒載體pcDNA3.1,其含有neomycin的基因,可選擇G418進(jìn)行篩選,根據(jù)教程需要提對(duì)不同濃度的G418進(jìn)行細(xì)胞篩選,選擇適篩選濃度,提供一個(gè)小tip!可以通過(guò)閱讀文獻(xiàn),選擇一定的濃度區(qū)間大梯度進(jìn)行篩選,在全部存活和死亡較多的兩個(gè)濃度間再設(shè)定濃度梯度進(jìn)行篩選,這樣得出的篩選濃度更為準(zhǔn)確。同時(shí)由于基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)需要一定時(shí)間才能夠表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì),但如果轉(zhuǎn)染時(shí)間較長(zhǎng),細(xì)胞代謝時(shí)間較久,轉(zhuǎn)染細(xì)胞也會(huì)逐漸減少,因此要合理控制進(jìn)行篩選的時(shí)間。注意:藥物篩選時(shí)細(xì)胞密度不要太低,否則密度太低全部篩死就可以快樂(lè)地進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)了。

轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

1、有效的驗(yàn)證方式必須是qPCR驗(yàn)證

2、熒光觀察,使用病毒轉(zhuǎn)染,明白自己病毒的情況,是熒光標(biāo)記(一般是GFP)還是非熒光標(biāo)記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,可以在載體上添加熒光標(biāo)記,幫助自己通過(guò)熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完-全證明轉(zhuǎn)染效率,還是通過(guò)核酸驗(yàn)證為準(zhǔn)確。

原創(chuàng)作者:上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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