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技術(shù)文獻(xiàn)

Western Blot蛋白質(zhì)磷酸化操作小貼士
閱讀次數(shù):1127 發(fā)布時間:2022/2/22 10:30:00
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WB 是檢測和定量磷酸化蛋白質(zhì)的重要實(shí)驗(yàn)方法,然而大家一直都說磷酸化蛋白 WB 不好做!WB 磷酸化蛋白曝不出條帶的時候,會特別沮喪。

遠(yuǎn)慕在此給大家列出幾點(diǎn)小建議,希望能幫助您改善一下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 

1、樣本是否表達(dá):
查閱資料或通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

2、對照設(shè)置:
陽性和陰性對照。
總蛋白抗體對照,對于特定時間的特定樣品,磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的總和代表該特定蛋白質(zhì)的總量。在相同的 WB 檢測中, 磷酸化蛋白質(zhì)的量增加通常伴隨著非磷酸化蛋白質(zhì)的降低。

3、內(nèi)參設(shè)置:
根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的內(nèi)參,如Actin、GAPDH 等

4、適當(dāng)?shù)奶崛》椒ǎ?br />蛋白質(zhì)提取的方法不僅影響提取效率,還會影響蛋白的質(zhì)量。建議采用裂解液裂解和超聲破碎組合的方式,可確保整個樣本充分裂解。

5、低溫操作:
室溫條件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。請勿反復(fù)凍融,操作時一定置于冰上。

6、加入抑制劑:
組織或細(xì)胞裂解時會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶,它會導(dǎo)致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必須在裂解液中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑。

7、重要的一點(diǎn):
檢測時選擇近紅外熒光標(biāo)記抗體,一次可檢測多個蛋白,無需多次曝片,方便檢測。一般磷酸化和總蛋白的條帶位置十分接近,傳統(tǒng)方式不易區(qū)分。

這樣大家在用WB檢測磷酸化水平時,是不是就方便多了,不用像傳統(tǒng)方法那樣,在壓完磷酸化抗體后,將膜 strip 后再壓總蛋白抗體;也不需要同時跑兩塊膠分別檢測。

使用近紅外熒光標(biāo)記抗體(二抗),孵育后直接放入儀器,一鍵成像,簡單快速!

原創(chuàng)作者:上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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