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問(wèn)：以前拿回細(xì)胞后，傳代、凍存后復(fù)蘇過(guò)幾次都沒(méi)什么問(wèn)題，*近因?qū)嶒?yàn)室孵箱污染，清潔消毒細(xì)胞室后，重新復(fù)蘇，結(jié)果連續(xù)復(fù)蘇6支，細(xì)胞均未貼壁，今晚復(fù)蘇6小時(shí)后觀察有一瓶相對(duì)貼壁細(xì)胞數(shù)較之前復(fù)蘇失敗瓶多，但貼壁細(xì)胞狀態(tài)不好，形態(tài)不佳，透光度亦不好！急求各位大俠會(huì)診指導(dǎo)！

答：juventus2004認(rèn)為復(fù)蘇過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題，是否是從液氮拿出直接放入溫水，還有培養(yǎng)箱，二氧化碳濃度，培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%，看看能否幫助貼壁，當(dāng)然也需要考慮血清問(wèn)題，還有確信拿來(lái)的細(xì)胞沒(méi)問(wèn)題。
 

pcspc9認(rèn)為首先應(yīng)該懷疑凍存，實(shí)際上復(fù)蘇出問(wèn)題的可能非常小，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，而且死板。

1、你凍存的時(shí)候是不是消化的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，這是一般人所注意不到的，即使書(shū)上也不講這個(gè)問(wèn)題，但我因?yàn)檫@個(gè)問(wèn)題就兩種肺癌細(xì)胞和一種肝癌細(xì)胞專門(mén)做過(guò)試驗(yàn)，這個(gè)絕對(duì)是絕大部分人細(xì)胞復(fù)不活的一個(gè)原因。太長(zhǎng)的消化時(shí)間會(huì)讓細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在你復(fù)蘇的時(shí)候細(xì)胞已進(jìn)入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。

2、你的凍存液好不好，是什么，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會(huì)死亡。

3、你的凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過(guò)7%，大于5%，太多也不好。

4、你在凍存的時(shí)候是不是把DMSO混均勻，這個(gè)有一些影響，但不算太大。

5、你的凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴(yán)格，很多人容易忘卻這個(gè)事情，因?yàn)檫@個(gè)東西流程長(zhǎng)。

6、如果你細(xì)胞污染，你是否能很快看到，我比我的導(dǎo)師能早一天看到污染。從這個(gè)角度講建議去除離心這步。

7、你的細(xì)胞在凍存前是否過(guò)密。

還有，我是不贊成孵箱污染這個(gè)概念的，所有在一個(gè)孵箱里的細(xì)胞都污染一個(gè)細(xì)菌的話，這個(gè)細(xì)菌是源于孵箱的，但這不代表孵箱污染，因?yàn)榉跸錈o(wú)論你如何處理都有大量的細(xì)菌，問(wèn)題在操作。我們的細(xì)胞房不換拖鞋，非常臟，別人的細(xì)胞都污染，很多細(xì)胞都污染到絕種，但我的只污染一次（兩年內(nèi)只有兩瓶），那次是因?yàn)閯e人給我動(dòng)了，我每次細(xì)胞擺放順序都是記住的。如果你老懷疑孵箱污染，那說(shuō)明你在養(yǎng)細(xì)胞這方面很差。

每次污染的原因都要盡可能的找，以后就不犯同樣的問(wèn)題，這個(gè)很重要，不能靠猜，否則你就有可能細(xì)胞養(yǎng)絕*后換課題，這個(gè)我見(jiàn)得太多了，別不當(dāng)會(huì)事。