蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。 一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)。
01 主要方法1. 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離（利用顆粒不同程度的顆粒吸附力來(lái)使分離的目的達(dá)到）。
2. 按照配體特性的分離-親和層析（利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異結(jié)合這一生物性質(zhì)）
3. 低溫有機(jī)溶劑沉淀法，使用如甲醇，乙醇等與水可混溶的有機(jī)溶劑，降低多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度并且將其析出，和鹽析相比較，這種方法的分辨率更加的高，然而蛋白質(zhì)比較容易變形，需要在低溫下進(jìn)行。
4. 按照分子大小不一樣的方法，密度梯度離心（在介質(zhì)中對(duì)蛋白質(zhì)離心時(shí)，蛋白質(zhì)沉降速度取決于它的質(zhì)量和密度，質(zhì)量和密度越大，那么沉降越快；凝膠過(guò)濾（一種柱層析）；超過(guò)濾（利用蛋白質(zhì)分子不能從半透膜通過(guò)的性質(zhì)）。
5. 按照溶解度差異分離，等電點(diǎn)沉淀法鹽溶與鹽析（使用一定濃度鹽溶液來(lái)使蛋白質(zhì)的溶解度增大或減小）；（因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子的凈電荷為0，使分子間靜電斥力減少了，所以，聚集沉淀比較容易，這時(shí)具有小的溶解度）。
6. 按照電荷不同的分離方法。主要分為離子交換層析和電泳分離。
02 操作步驟：1. 所有在純化系統(tǒng)里使用的溶液當(dāng)日都需要經(jīng)過(guò)0.22μm的濾膜抽濾、脫氣處理；保存4℃冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復(fù)至室溫后抽濾脫氣；
2. 樣品上柱純化，需先濾膜過(guò)濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、緩沖液洗泵；設(shè)置流速和柱警報(bào)壓（壓力值參閱層析柱及填料說(shuō)明書，取較小的一個(gè)大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；
4. 當(dāng)柱子限壓在0.3MPa，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時(shí)，pH valve 中的Restirtor 可以切換成Off line，即顯示By-pass狀態(tài)；
5. 當(dāng)需要通過(guò)
儀器上樣環(huán)上樣時(shí)，將W1閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過(guò)注射器倒吸樣品上樣；
6. 進(jìn)樣閥“Inject”為上樣狀態(tài)。上樣結(jié)束可將進(jìn)樣閥切換回“Load”狀態(tài)。并用純水認(rèn)真清洗上樣環(huán)至少3次；將W1閥口處換回原來(lái)接頭閥門。
7. 純化結(jié)束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用20%的乙醇清洗泵以及系統(tǒng)。長(zhǎng)期不用，層析柱應(yīng)保存在20%的乙醇中，泵放置在20% 乙醇中；
8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)傾倒廢液瓶里的廢液；
03 注意事項(xiàng)1.為了避免蛋白質(zhì)變性，不要對(duì)樣品劇烈攪動(dòng)和反復(fù)凍融。
2.緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)。。
3.為了避免蛋白質(zhì)的氧化，將0.1~1mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或β-巰基乙醇）加入到緩沖溶液中。
4.為了避免重金屬對(duì)目標(biāo)蛋白的破壞，將1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑加入。
5.為了避免微生物生長(zhǎng)，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質(zhì)的時(shí)候，均必須時(shí)刻對(duì)它的穩(wěn)定性注意維護(hù)，使它的活性得到保護(hù)，需要牢記如下一些通用的注意事項(xiàng)。
6.盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行操作
7.蛋白濃度不要太稀。
8.除非是進(jìn)行聚焦層。否則pH需要合適，防止所使用的緩沖溶液pH與pI相同，使蛋白質(zhì)的沉淀得以避免。
9.使用蛋白酶抑制劑，避免蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解；在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，將DNA酶加入來(lái)使得DNA降解，避免DNA對(duì)蛋白的污染。
客服一
