質(zhì)粒提不出來或得率較低咋辦？
閱讀次數(shù)：840 發(fā)布時間：2021/5/28 10:23:37
1.大腸桿菌老化：請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
2. 質(zhì)�？截悢�(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3. 菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
4. 堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
5. 溶液使用不當：溶液P2、P3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
6. 吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。
7. 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時) ：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
8. 乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
9. 洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到蕞大洗脫效率。
10. 洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
11. 洗脫體積太�。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
12. 洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1分鐘可達到較好的效果。
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