質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或者表達(dá)的重要媒介，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)。目質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)大多借助試劑盒來(lái)完成，那么關(guān)于質(zhì)粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？
目，質(zhì)粒提取試劑盒蕞常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來(lái)分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來(lái)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤(pán)繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌
蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物。這樣，通過(guò)離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，再采用吸附柱對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行吸附、去雜質(zhì)、洗脫，就完成了質(zhì)粒提取的實(shí)驗(yàn)。
在進(jìn)行質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)室，有時(shí)候質(zhì)粒提取的濃度不高，達(dá)不到后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面一起來(lái)看一下質(zhì)粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整，從而得到更高濃度的質(zhì)粒樣本啦！
影響質(zhì)粒提取的因素：
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類(lèi)和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)�？截悢�(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素等。
宿主菌的種類(lèi)和培養(yǎng)條件
多數(shù)情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖類(lèi)，如果沒(méi)有完全去除，將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。
由于無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞在無(wú)抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。因此，宿主菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過(guò)程中，務(wù)必加入抗生素進(jìn)行篩選。宿主菌接種到含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，不應(yīng)超過(guò)16小時(shí)。超過(guò)16小時(shí)后，細(xì)胞開(kāi)始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
不同質(zhì)粒間的差異
質(zhì)粒提取終的濃度，重要的影響因素就是質(zhì)�？截悢�(shù)。質(zhì)�？截悢�(shù)是指生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目，每個(gè)細(xì)菌中的質(zhì)粒的拷貝數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。
按照復(fù)制機(jī)制，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)菌內(nèi)只含1-2個(gè)質(zhì)粒；另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)菌內(nèi)一般含20個(gè)左右質(zhì)�？截�，這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質(zhì)粒與低拷貝質(zhì)粒在相同條件下進(jìn)行質(zhì)粒提取，高拷貝質(zhì)粒濃度會(huì)高于低拷貝質(zhì)粒的濃度。不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，菌液量的需求不同，對(duì)于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。
在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。因?yàn)槁让顾啬芤种扑拗骷?xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對(duì)松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒(méi)有影響。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長(zhǎng)，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質(zhì)粒提取的濃度。
客服一
