相信如何提高目的重組
蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量是很多同學(xué)在研究中都會(huì)遇到的問(wèn)題。泡了無(wú)數(shù)論壇，看了無(wú)數(shù)帖子，嘗試過(guò)IPTG的誘導(dǎo)濃度、培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間，甚至讓別的公司幫忙做密碼子優(yōu)化（將目的片段通過(guò)全基因合成的方式合成出來(lái)）。總的來(lái)說(shuō)，提高IPTG濃度是可以提高目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量的，但一般也就用到1mM的濃度，再高對(duì)細(xì)胞有毒性； 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)越豐富，表達(dá)量越高，所以如果追求表達(dá)量的話，就不要用LB培養(yǎng)基了，用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基吧； 誘導(dǎo)溫度，溫度越低表達(dá)量越低，但是可溶的比例一般來(lái)說(shuō)會(huì)越高，所以如果追求表達(dá)量可以嘗試37℃或者42℃（沒(méi)試過(guò)42℃）；誘導(dǎo)時(shí)間，這個(gè)跟培養(yǎng)基成分及供氧情況很有關(guān)系，如果供氧不足/營(yíng)養(yǎng)不夠，提高時(shí)間會(huì)起到反效果。
綜合而言，一般用的重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件是固定的，有時(shí)候要追求可溶表達(dá)，頂多就調(diào)整下誘導(dǎo)溫度（25℃）。條件就是：自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（不用額外的IPTG），37℃，20h。一般來(lái)說(shuō)大分部蛋白的表達(dá)量都還可以。
但有些蛋白的表達(dá)量不行，或者某些蛋白需要長(zhǎng)期大量使用，因此提高這些重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量就十分有必要了，如果進(jìn)一步提高呢？
我們都知道，蛋白質(zhì)的表達(dá)量和蛋白質(zhì)的翻譯效率有關(guān)，翻譯效率又跟mRNA的二結(jié)構(gòu)又有關(guān)系，如果mRNA形成了復(fù)雜的二結(jié)構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致核糖體無(wú)法順暢的將整個(gè)mRNA讀通，甚至?xí)釓膍RNA上掉下來(lái)。一般公司號(hào)稱的密碼子優(yōu)化，也就是通過(guò)替換掉一些稀有密碼子，顯然如果不從二結(jié)構(gòu)上考慮的話，是沒(méi)法提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量的，而事實(shí)也確實(shí)如此。在公司做研發(fā)的幾年中，做過(guò)多個(gè)蛋白的密碼子優(yōu)化（通過(guò)全基因合成的方式），結(jié)果差強(qiáng)人意。
天介紹的方法，不是從二結(jié)構(gòu)上來(lái)預(yù)測(cè)的（據(jù)我所知，目沒(méi)有比較準(zhǔn)確的方法來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的二姐結(jié)構(gòu)），而是一種簡(jiǎn)單、高效的方法：通過(guò)優(yōu)化目的基因的5＇部分DNA序列，而且不需要通過(guò)軟件預(yù)測(cè)，完全隨機(jī)，包含所有可能（理論上），且不改變氨基酸序列。
原理：蛋白質(zhì)的翻譯效率很大程度上跟翻譯起始效率有關(guān)，因此mRNA的5＇端必須得很好翻譯，好不要有復(fù)雜的二結(jié)構(gòu)；通過(guò)PCR的方法在基因的5‘端引入簡(jiǎn)并序列，構(gòu)建克隆，挑選多個(gè)克隆，誘導(dǎo)表達(dá)之，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)量的高低，挑選高表達(dá)克隆進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.設(shè)計(jì)目的重組蛋白質(zhì)的N端10-15個(gè)氨基酸的簡(jiǎn)并序列。
2.引物合成上述簡(jiǎn)并序列，同時(shí)設(shè)計(jì)合成目的基因反向引物。
3.PCR擴(kuò)展目的基因，這樣在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同時(shí)不改變氨基酸序列。
4.雙酶切，插入到目標(biāo)載體。
5.轉(zhuǎn)化。
6.挑選多個(gè)克�。ū热�100-200個(gè)）到1.5ml EP管，直接誘導(dǎo)表達(dá)（記得帶上為改造克隆菌株的對(duì)照）。
7.SDS-PAGE檢測(cè)。
8.挑選高表達(dá)的多個(gè)克隆，測(cè)序。
客服一
