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超濾法濃縮蛋白質(zhì)溶液實驗
閱讀次數(shù)：457 發(fā)布時間：2022/8/3 13:31:32

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實驗方法原理超濾濃縮蛋白質(zhì)是通過外力使蛋白質(zhì)溶液通過濾膜而仍保留目的蛋白質(zhì)的方法。實驗室超濾主要是針對小體積蛋白質(zhì)溶液（幾毫升），用離心力的方法使溶液很容易通過濾膜。我們以 Amicon 系作為超濾的實例進行描述。這個方法不易引起蛋白質(zhì)變性。

微型濃縮器初始容量有 2 ml 以及更小的，2 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）樣品 2 ml 離心 30 min 可使體積濃縮至 50 ul 以下，然而濃縮的時間依所用超濾膜的類型、緩沖液的組成以及蛋白質(zhì)的種類和濃度等因素而定。通過向濃縮的蛋白質(zhì)溶液中加入新緩沖液及再離心，能很方便地更換蛋白質(zhì)溶液的緩沖液和脫鹽，四種型號濃縮器 Centricon-3、10、30 和 Centricon-100 分別能截留平均分子量為 3，10, 30 和 100 kD 的蛋白質(zhì)組分。

實驗材料蛋白質(zhì)溶液

試劑、試劑盒

儀器、耗材 Amicon Centricon 微型濃縮器磁力攪拌器和攪拌子

實驗步驟

1. 組裝 Centricon 微型濃縮器并加 2 ml 樣品到樣品池內(nèi)；

2. 5000 × g 離心 30 min；

3. 去掉樣品池的過濾管，蓋上回收管；

4. 倒置濃縮器 1000 × g 離心 2 min；

5. 濃縮樣品將移入回收管。另外用少量緩沖液洗滌濾器，能較完全地回收蛋白質(zhì)。

注意事項

1. 離心時間依樣品性質(zhì)而定。一般含有甘油的黏性溶液或蛋白質(zhì)濃度較高時，需要離心時間較長。

2. 在典型的蛋白質(zhì)回收率可高達 90％以上。

3. 目的蛋白的分子置應(yīng)大于濃縮器截流組分分子量的 30％～50％，以確保目的蛋白截留成功。

4. 不同的濾膜具有不同的平均孔徑，有利于根據(jù)蛋白質(zhì)的大小選擇合適的濾膜去濃縮蛋白。

5. Centricon 微量濃縮器的設(shè)計適用于固定角度的離心轉(zhuǎn)頭。由恰當?shù)碾x心轉(zhuǎn)頭角度，使樣品在達到死腔體積為 25～40 ul 時，不進一步濃縮，這樣防止了樣品被濾干。

6. 其他離心的超濾系統(tǒng)還有 Amicon Centriflo （7 ml 容積）和 Centriprep （15 ml 容積）兩種濃縮器。

7. 為了濃縮大體積的樣品，采用加壓超濾系統(tǒng)耗時較長。Amicon 生產(chǎn)的帶攪拌室超濾系統(tǒng)可適用于幾百毫升溶液的濃縮。更大體積時則使用螺旋狀的、蜂窩狀纖維、或盒型膜裝置。

8. Penefsky （1977）提出了一種可用于凝膠過濾脫鹽的簡單離心柱。